ESWT促進ACL殘留物細胞的活化，并增強對細胞增殖、遷移、膠原合成和分化的旁分泌調節作用
目的 方法 結果 結論 文章重點 ACL重建后，前交叉韌帶（ACL）殘留物與周圍細胞之間的相互作用，以及體外沖擊波（ESW）對ACL殘留物細胞活性和周圍細胞旁分泌調節的影響。 關鍵信息 - 在保留ACL殘留物的ACL重建后，ACL殘留物通過調節骨髓基質細胞（BMSCs）的增殖、遷移、膠原基因表達和肌腱分化潛力來幫助移植物成熟。 - ESW刺激了ACL殘留物細胞的存活率、增殖、遷移以及膠原合成、轉化生長因子β（TGF-β）和血管內皮生長因子（VEGF）的表達。 - 總體而言，ESW治療不僅刺激了ACL殘留物細胞的活性，還顯著增強了其對周圍細胞的調節能力，這將有助于移植物的成熟。 優勢和局限性 - 第一項研究確認了ACL殘留物與周圍細胞之間的相互作用，以及ESW對ACL殘留物細胞及其對周圍細胞的調節能力的影響。 - 我們在體外研究了ESW對ACL殘留物細胞的影響，但沒有使用動物研究驗證這些發現。 - 沒有研究ESW治療ACL殘留物細胞和促進組織再生的最佳劑量和頻率。 引言 膝關節損傷，尤其是涉及前交叉韌帶（ACL）的損傷，在運動中很常見。由于ACL位于關節內，血液供應有限，并且存在細胞丟失，因此受傷的ACL愈合效果較差。在臨床實踐中，ACL重建手術可以恢復關節功能和運動能力。植入的移植物在ACL重建后的主要關注點是在移植-隧道界面的骨性整合和關節內移植物的重塑（韌帶化）。植入后，移植物壞死導致生長因子和細胞因子的分泌，從移植物周緣（骨髓、滑膜和原有ACL的殘余）向損傷部位引導細胞遷移。這些遷移的細胞進一步增殖并產生細胞外基質，并在生長因子的刺激下進行肌腱分化，促進韌帶愈合。因此，了解ACL殘余組織和細胞以及周圍細胞在增殖、遷移、膠原合成、生長因子的分泌和分化方面的調節機制對于加速移植物早期愈合并預防ACL重建后的移植物斷裂至關重要。 ACL重建中的殘留物保護技術被提出來改善功能結果，通過增強細胞增殖、再血管化和本體感覺器官的再生來增加移植物的融合。然而，關于ACL重建中殘留物保護的臨床價值和結果仍存在爭議。ACL殘留物被證明含有干細胞，并且在體外研究中顯示其增強了肌腱與骨隧道的愈合能力。在ACL重建過程中，ACL殘余物環繞著植入的移植物，并與周圍的組織和細胞接觸（例如，來自鉆孔骨隧道的骨髓基質細胞（BMSCs）覆蓋著ACL殘余物和植入的移植物；圖1中間和右側的圖像）。然而，ACL殘留物細胞在移植物再生中的實際作用以及它們與周圍細胞的相互作用尚不清楚。 體外沖擊波（ESW）是一種特點是短周期內快速壓力上升和高峰壓力的聲波，已被應用于治療多種骨科疾病。ESW治療的可能機制包括機械力刺激、信號通路轉導、生物分子分泌、離子通道改變以及細胞因子和生長因子的釋放。ESW治療促進軟組織再生。研究表明，ESW治療激活了不同細胞的增殖、遷移和基因表達。ESW已被提出作為ACL重建手術后促進移植物愈合的非侵入性治療方法。Wang等人對ACL重建術后使用長指伸肌腱的兔子進行了500次14千伏的沖擊波治療，并證明在移植的肌腱與骨隧道接口處愈合顯著改善。盡管這些結果令人鼓舞，但需要在體外闡明ESW對ACL殘留物和周圍細胞的生化過程的影響，以更好地指導隨后的臨床研究，評估ESW在ACL重建后改善移植物成熟的效果。 本研究假設ACL殘留物細胞會調節周圍細胞的行為，包括它們的增殖、遷移和膠原形成。我們還假設ESW治療不僅會激活ACL殘留物細胞，還會增強它們的旁分泌和下游調節BMSC活性和分化的能力。 方法 細胞分離：從接受ACL重建手術的8名患者（男性5名，女性3名；平均年齡23.5歲（標準差3.46）；平均受傷時間3.3個月（標準差1.6））獲取ACL殘余組織。這些ACL殘余組織在手術過程中通過關節鏡切?。▓D1左圖）。該研究程序已獲得機構審查委員會的批準（KMUHIRB-F（I）-20160112）。去除外腱和周腱鞘后，將殘余組織切成1mm至2mm厚的小塊，并用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌。將組織以1000rpm，25°C的速度離心5分鐘，收集后在低葡萄糖的Dulbecco修飾的鷹嘴豆培養基（Gibco DMEM；Thermo Fisher Scientific，Waltham，Massachussetts，USA）中培養，添加10%胎牛血清（Gibco FBS；Thermo Fisher Scientific）和1%抗生素（青霉素/鏈霉素；Gibco；Thermo Fisher Scientific），在37°C的5% CO2孵化箱中培養。在經過7到10天的時間內，從殘余組織中遷移出的細胞經過無膠原酶消化的處理，稱為P0代，并用0.25%胰蛋白酶（Gibco；Thermo Fisher Scientific）進行次級培養，直到達到80%的密度。本研究使用第三代ACL殘留物細胞。 從骨髓中分離兔子的BMSCs，前期通過髂嵴抽取8ml骨髓液并培養。動物實驗方案已獲得機構動物護理和使用委員會（IACUC）的批準（KMU-105263）。本研究使用第三代BMSCs。 ESW治療方案：使用電磁沖擊波發生器以聚焦模式施加ESW治療。密度為1×106個細胞/毫升的第三代殘余細胞被放置在低溫瓶中，并接受1000次沖擊波刺激，刺激強度為0.15 mJ/mm2。對照組不接受ESW治療。 ACL殘留物細胞與BMSCs的共培養：為了研究ACL殘留物細胞對其他細胞的調節能力，我們使用透明的系統（4μm孔徑）將人類ACL殘留物細胞與兔子BMSCs進行非接觸式共培養。將1×105個BMSCs種植在含有MEM α（Gibco；Thermo Fisher Scientific）添加了10% FBS和1%抗生素（青霉素/鏈霉素）的培養板底部（下孔）上，在37°C和5% CO2條件下孵化。24小時后，廢棄培養基，然后將未經ESW處理的ACL殘留細胞（ACL-ESW共培養組）或經過ESW處理（1000次沖擊波刺激，刺激強度0.15 mJ/mm2）的ACL殘留細胞（ACL+ESW共培養組）種植在穿透式孔板（上孔）上，加入培養基（低葡萄糖DMEM，無血清，1%抗生素（青霉素/鏈霉素）；全部來自Gibco；Thermo Fisher Scientific）。作為對照組，1×105個BMSCs在沒有與ACL殘留物細胞共培養的情況下進行單層培養。經過七天后，每組中的BMSCs以0.25%胰蛋白酶脫離并進行次級培養，以便進行其他實驗。 細胞存活率。根據制造商的說明，通過MTT測定法確定ESW處理和未處理的ACL殘余細胞以及共培養實驗中所有的BMSCs（對照組、ACL-ESW共培養組和ACL+ESW共培養組）的細胞存活率。本研究使用ACL殘余細胞和BMSCs的第三代細胞。這些細胞以5×103個細胞/孔的密度在含有200μl培養基（MEM α添加了10% FBS和1%青霉素/鏈霉素）的96孔板中培養，以37°C孵化48小時。使用Bio-Rad Microplate Manager Benchmark Plus Reader (Bio-Rad Laboratories, Hercules, California, USA)在570nm處測量吸光度。比較ESW處理和未處理的ACL殘余細胞之間以及對照組、ACL-ESW共培養組和ACL+ESW共培養組之間的BMSCs的結果。 細胞增殖-EdU檢測。根據制造商的說明，使用Click-iT EdU檢測試劑盒（Thermo Fisher Scientific）分析細胞的增殖比率。在不同的共培養組中，ESW處理和未處理的ACL殘余細胞以及BMSCs的第三代細胞在含有2ml培養基（MEM α添加了10% FBS和1%青霉素/鏈霉素）的12孔板中以2×104個細胞/孔的密度培養，以37°C孵化48小時。使用安裝介質制備細胞載玻片，并用Hoechst 33342（Sigma-Aldrich，St. Louis，Missouri，USA）進行染色10分鐘。使用熒光顯微鏡（Leica Microsystems CMS GmbH，Wetzlar，Germany）觀察載玻片。細胞增殖率通過ImageJ（64位Java版本1.6.0_24;國家衛生研究院（NIH），Bethesda，Maryland，USA）計算，每個樣品采用計算機化階段設置隨機抓取的五個區域進行分析，研究人員對研究組進行了盲目分析。 RNA提取和實時聚合酶鏈反應。在不同的共培養組中，ESW處理和未處理的ACL殘余細胞以及BMSCs的第三代細胞在含有3ml培養基（MEM α添加了10% FBS和1%青霉素/鏈霉素）的6孔板中以2×105個細胞/孔的密度培養，以37°C孵化48小時。使用RNAzol試劑（MRC Inc，Cincinnati，Ohio，USA）提取總RNA。然后，使用Thermo Scientific Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Fisher Scientific）按照制造商的說明，將純化的總RNA逆轉錄為cDNA。 實時PCR使用SYBR Green PCR Master Mix（Thermo Fisher Scientific）在ABI 7900實時PCR儀器上進行。每個反應（20μl）均以三重復進行，并含有1μl的互補DNA（cDNA）模板和相應的引物（表I）。對于所有測試基因的閾值周期（Ct）進行了GAPDH的歸一化（ΔCt）。將每個實驗樣品與其對照（ΔΔCt）進行比較。折疊變化值表示為2^-ΔΔCt。 劃痕遷移實驗。該實驗旨在確定ESW處理和未處理的ACL殘余細胞以及不同共培養組中BMSCs的遷移速率。來自每個組的第三代細胞以3 × 105個細胞/板的密度在6孔板中培養，并在37°C的5% CO2孵化箱中孵化。當細胞達到> 90%的密度時，使用無菌的200μl移液器尖端刮傷板。通過定期間隔（ESW處理和未處理的ACL殘余細胞為8、16、24、32小時；不同共培養組中的BMSCs為12、24、36、48小時）觀察實時細胞遷移狀態，閉合劃痕間隙。使用ImageJ計算細胞遷移速率的相對變化。 轉移遷移實驗。在一個孔徑為8μm的6.5mm Transwell孔板（EMD Millipore, Billerica, Massachusetts, USA）中進行體外細胞遷移實驗。在上腔室中接種ESW處理和未處理的ACL殘余細胞以及不同共培養組中的BMSCs（每孔3×104個細胞），培養基中不含血清。在下腔室中加入含有10% FBS和1%青霉素/鏈霉素的MEM α作為趨化劑。在37°C孵化20小時后，遷移到下膜表面的細胞用4%福爾馬林（PFA）固定10分鐘，然后用0.5%結晶紫染色20分鐘。在顯微鏡下計算每個孔中遷移的細胞數，并將其歸一化到對照組的細胞數。相對細胞遷移能力通過遷移的處理細胞與對照組細胞的比率計算得到，并表示為遷移率（相對于對照組的百分比）。每個反應均進行了三次重復，并從這些結果中得出平均值。 免疫熒光染色。ACL殘余細胞，包括ESW處理和未處理的細胞，以及不同共培養組中的BMSCs被接種在含有2ml培養基（MEM α添加了10% FBS和1%青霉素/鏈霉素）的16mm玻片上，每孔密度為2×104個細胞，并在37°C孵化48小時。然后，用4%福爾馬林固定細胞15分鐘和1%Triton-X-100處理1分鐘，接著使用100μl阻斷溶液（1% FBS在PBS中）預孵育20分鐘。使用針對I型膠原（Sigma-Aldrich）、III型膠原（Arigo Biolaboratories）、轉化生長因子β（TGF-β; Sigma-Aldrich）和VEGF蛋白（Arigo Biolaboratories）的初級抗體，在4°C過夜對細胞進行染色。然后，使用熒光二級抗體進行染色；山羊抗羊免疫球蛋白G（IgG）（H + L）-FAM（1:250; Leadgene Biomedical）用于ACL殘余細胞中的I型膠原和TGF-β，以及BMSCs中的I型和III型膠原；山羊抗小鼠IgG（H + L）-TAMRA（1:250; Leadgene Biomedical）用于BMSCs中的TGF-β和ACL殘余細胞以及BMSCs中的VEGF，持續一個小時，并用PBS洗滌三次。載玻片使用1μg/ml的Hoechst溶液（Sigma-Aldrich）對ACL殘余細胞和BMSCs使用DAPI進行染色十分鐘，然后用PBS洗滌三次，并在觀察之前裝載。使用ImageJ對六個樣本中五個隨機區域的熒光強度進行定量分析，這些區域通過計算機化階段設置隨機抓取，由對研究組進行盲目分析的科學家進行分析。與未經ESW處理的ACL殘余細胞相比，ESW處理后ACL殘余細胞的熒光強度結果顯示為倍數變化。 統計分析。使用配對t檢驗分析ESW處理和未處理的ACL殘余細胞之間的差異。在共培養實驗中，使用單因素方差分析（ANOVA）和Tukey事后檢驗比較對照組、ACL-ESW共培養組和ACL+ESW共培養組之間的結果。所有數據均以平均值（標準差）表示。p < 0.05被視為具有統計學意義。所有統計分析使用SPSS軟件版本20（IBM，紐約州阿蒙克）進行。 結果 ESW治療增加了ACL殘留細胞的存活能力、增殖能力和遷移能力。ACL殘余細胞的存活能力在ESW治療后的72小時內顯著增加（圖2a）。與未經處理的細胞相比，ESW治療后ACL殘余細胞的增殖率在EdU實驗和Ki67基因表達中明顯增加（圖2b）。此外，ESW治療后的ACL殘余細胞比未經處理的細胞更積極地遷移入劃痕區域（上面板）或下室（下面板）（圖2c）。 ESW治療上調了ACL殘余細胞中COL-I A1、TGF-β和VEGF的表達。我們進行了免疫熒光染色以檢測ESW治療后COL-I A1、TGF-β和VEGF的表達。與未經處理的細胞相比，ESW治療后ACL殘余細胞中COL-I A1、TGF-β和VEGF蛋白水平顯著上調（圖3）。 BMSC（骨髓間充質干細胞）與帶有和不帶有ESW刺激的ACL殘余細胞共培養后，其增殖和遷移速率增加。BMSC的細胞存活能力在對照組、ACL-ESW共培養組和ACL+ESW共培養組之間沒有顯著變化（圖4a）。BMSC在與ACL殘余細胞共培養后（無論是經過ESW處理還是未處理），根據EdU實驗和Ki67基因表達水平，顯示出較高的細胞增殖率（圖4b）。劃痕遷移實驗顯示，在與ACL殘余細胞共培養12小時或更長時間后，BMSC的遷移率顯著增加，并且ACL+ESW共培養組在所有時間點上的遷移率最高（圖4c上面板）。這些結果與Transwell遷移研究結果一致（圖4c下面板）。在增殖和遷移研究中，ESW處理后的ACL殘余細胞對BMSC的活性影響更為顯著，相比于未經ESW處理的ACL殘余細胞。 ESW增強了ACL殘余細胞上調BMSC膠原基因表達和肌腱分化的能力，但不影響TGF-β和VEGF的表達。與對照組相比，與ACL殘余細胞共培養的BMSC顯示出明顯增加的I型和III型膠原水平（圖5）和肌腱基因（Scx和TNC）表達（圖6）。在三個組中，ACL+ESW共培養組的BMSC顯示出最高的膠原和肌腱標記物基因表達。在對照組和ACL殘余細胞共培養組之間，TGF-β和VEGF基因表達沒有顯著差異。 討論 增強ACL殘余和周圍細胞的增殖、遷移和分化對于改善ACL重建后移植物成熟至關重要。本研究表明，ACL殘余細胞通過旁分泌作用調節了BMSC的增殖、遷移、膠原合成和肌腱分化。與未經處理的細胞相比，ESW治療激活了ACL殘余細胞的細胞存活能力、增殖、遷移，并增加了COL-I A1、TGF-β和VEGF的表達，并且在ESW刺激后，它們對BMSC的旁分泌作用進一步增強，相比于未經ESW處理的ACL殘余細胞。因此，ESW治療可以通過激活殘余細胞并增強其旁分泌作用來調節周圍細胞的增殖、遷移、合成膠原和分化，從而改善ACL重建后的移植物成熟。 研究發現，ACL殘余組織中含有間充質和血管干細胞，這些細胞在損傷修復中起重要作用。然而，另一項研究表明，存在ACL殘余細胞時，結構較差，移植物愈合能力較低。同樣，Lu等人指出，保留的肌腱殘端保持了干性，增殖率較正常肌腱低。因此，僅通過未經刺激的ACL殘余細胞改善移植物再生的能力是有限的。ESW通過不同的途徑在不同的細胞中調節細胞增殖和遷移。震蕩波通過PI3K/AKT途徑促進神經干細胞的增殖，并通過激活mTORC1/FAK信號通路調節脂肪來源的間充質干細胞的增殖。ESW治療還促進了來自斷裂跟腱的人體腱細胞的增殖和遷移。在本研究中，ESW治療增強了ACL殘余細胞的增殖、遷移和膠原合成，促進了ACL重建后細胞遷移和增殖。然而，ESW如何增強ACL殘余細胞的實際機制仍需進一步闡明。 生長因子的分泌和誘導是組織再生的重要過程，它們促進移植物的愈合。震蕩波機械傳導誘導了BMSC、間充質干細胞和韌帶成纖維細胞中TGF-β的表達。在ACL重建過程中，TGF-β在TGF-β/MAPK信號通路中增強了肌腱-骨結合，減少了瘢痕組織進入隧道，促進膠原纖維形成，并增加了纖維細胞數量，對兔模型具有較好的預后。此外，TGF-β通過增強ACL成纖維細胞的增殖和基質合成介導了ACL重塑。一些研究報道，震蕩波通過上調VEGF或其受體VEGFR2水平促進血管生成，并促進心臟、肌腱和肌腱-骨結合的再生。在免疫缺陷大鼠中，ACL殘余來源的CD34+（內皮干細胞標記物）細胞通過激活血管生成和VEGF分泌來增強肌腱-骨愈合。在本研究中，我們觀察到ACL殘余細胞在ESW處理后分泌的TGF-β和VEGF水平升高。因此，基于ESW的機械傳導可能激活ACL殘余細胞釋放TGF-β和VEGF，進一步增強ACL重建后移植物的再生能力。 在ACL重建中保留殘余物的情況下，ACL殘余物與周圍組織和細胞之間的實際關系尚不清楚。本研究模擬了ACL重建過程中的情況，即植入的移植物穿過ACL殘余物，并被來自鉆孔骨隧道釋放的BMSC覆蓋。我們的研究結果顯示，與ACL殘余物細胞共培養可以增強BMSC的增殖、遷移、分化以及膠原合成和肌腱相關基因的表達。然而，我們觀察到與ACL殘余物細胞共培養后，BMSC的存活率和生長因子的分泌（TGF-β和VEGF）并未改變，這表明ACL殘余物細胞保留了分泌旁分泌因子調節周圍細胞活性和分化的能力，而不影響細胞的存活率和生長因子的分泌。這些結果提供了一個新的概念，即ACL殘余物細胞可以調節周圍細胞的活性和分化，增強ACL重建過程中的移植物愈合。ESW治療已被證明可以刺激靶細胞的活性。然而，ESW處理的細胞與其他細胞的相互作用尚未得到很好的研究。本研究中，ESW治療激活了ACL殘余物細胞的存活率、遷移、膠原合成以及TGF-β和VEGF的表達。此外，與ESW處理的ACL殘余物細胞共培養更深入地調節了BMSC的增殖、遷移、膠原表達和肌腱分化，相比于未經ESW處理的ACL殘余物細胞共培養和對照組。結果表明，ESW可能不僅直接激活靶細胞，而且通過促進分泌調節周圍細胞活性和分化的因子來激活周圍細胞。然而，與ESW處理的ACL殘余物細胞共培養后，BMSC的存活率和生長因子的分泌并未改善，因此與未經ESW處理的ACL殘余物細胞共培養和對照組的結果沒有顯著差異。這些發現表明，ESW治療可以增強靶細胞的固有能力，但無法創造新功能來調節周圍細胞。 在臨床實踐中，ESW不僅會傳遞到ACL殘余物，還會傳遞到重建區域的其他組織（例如肌腱移植物、骨髓、滑膜）。Vetrano等人的研究發現，ESW促進了ACL重建過程中取自半腱肌肌腱的肌腱細胞的增殖和膠原合成。Suhr等人的研究報道，ESW應用增加了人類BMSC的生長速率、增殖和遷移，并降低了凋亡率。他們的實驗結果還顯示，ESW可以誘導肌動蛋白骨架的重塑，并在ESW處理后保持BMSC的分化潛能。Wang等人首次研究了兔ACL重建模型中ESW的效果，他們的研究結果顯示，ESW治療顯著增強了移植肌腱與骨隧道之間的界面愈合，從組織形態學和拉伸強度測試中得出。此外，Wang等人將ESW治療（1,500脈沖，20千伏）應用于接受保留ACL殘余物重建手術的患者的脛骨隧道中，即在同一麻醉期間立即進行治療。兩年后的隨訪中，接受ESW治療的ACL重建患者的Lysholm評分顯著改善，脛骨隧道擴大減少，與未接受ESW治療的患者相比有所改善。本研究首次提出并證明了ESW可以增強ACL殘余物細胞的活性和其對BMSC的調控作用，這可能有助于移植物的成熟。然而，需要進一步研究ACL殘余物、肌腱細胞、BMSC和ESW刺激下的其他組織之間的相互作用，以澄清ESW對ACL重建中移植物成熟的影響。本研究存在一些局限性。首先，我們僅在體外研究了ESW對ACL殘余物細胞的影響，但尚未通過動物實驗驗證這些發現。其次，我們承認間接共培養人類ACL殘余物細胞和兔BMSCs，僅觀察ACL殘余物細胞對周圍細胞的調控作用是有局限性的。為了了解ACL重建的臨床情況，需要進行同一物種的ACL殘余物細胞和周圍細胞的直接接觸共培養研究。第三，我們沒有闡明ESW治療對ACL殘余組織的臨床效果和精確機制。在臨床應用ESW之前，需要確定其對治療ACL殘余物細胞和促進組織再生的最佳劑量和頻率。幾項研究報道了ESW對各種細胞活動和受損組織愈合的劑量依賴性影響。據我們所知，迄今為止還沒有驗證ACL殘余物細胞的最佳ESW劑量的研究。未來的實驗應該致力于在體外細胞研究和保留殘余物的ACL重建動物模型中總結，我們的研究揭示了一些新的發現。我們證明了ACL殘余物細胞通過增加周圍細胞的增殖、遷移、膠原合成和分化來調節周圍細胞的活動。ESW治療不僅激活了ACL殘余物細胞的活力、遷移、膠原合成和TGF-β、VEGF的分泌，還顯著增強了其對周圍細胞的旁分泌能力，從而增強了移植物的愈合。這些結果支持了在保留ACL殘余物的ACL重建中應用ESW來增強移植物成熟的證據。 參考文獻 略
前交叉韌帶（ACL）殘留物和周圍細胞的增殖、遷移和分化是ACL重建的基本過程；然而，ACL殘留物和周圍細胞之間的相互作用尚不清楚。我們假設ACL殘留物細胞保留了調節周圍細胞活性、膠原基因表達和肌腱分化的能力。此外，體外沖擊波（ESW）不僅可以促進ACL殘留物細胞的活性，還可以增強它們對周圍細胞的旁分泌調節。
比較了未經處理和經過ESW處理（0.15 mJ/mm2，1000次沖擊，4 Hz）的ACL殘留物細胞的細胞存活率、增殖、遷移和Collagen-I (COL-I) A1、轉化生長因子β (TGF-β) 和血管內皮生長因子（VEGF）的表達水平。為了評估對周圍細胞的后續影響，使用共培養系統研究了骨髓基質細胞（BMSCs）的存活率、增殖、遷移和I型膠原、III型膠原和肌腱基因（Scx、TNC）的表達水平。
經過ESW處理的ACL殘留物細胞表現出更高的細胞存活率、增殖、遷移和COL-I A1、TGF-β和VEGF的表達增加。與單獨培養的BMSCs組相比，與ACL殘余細胞共培養后，BMSC的增殖和遷移率顯著增加，無論是否經過ESW刺激。此外，ESW顯著增強了ACL殘留物細胞上調膠原基因表達和BMSCs的肌腱分化能力，而不影響細胞存活率、TGF-β和VEGF的表達。
ACL殘留物細胞調節了周圍細胞的活性和分化。結果表明，ESW增強了ACL殘留物細胞的存活率、增殖、遷移和膠原、TGF-β、VEGF的表達，以及對BMSC增殖、遷移、膠原表達和肌腱分化的旁分泌調節能力。
